Klonierung

Unter dem Begriff Klonierung wird in der Molekularbiologie eine Methode bezeichnet, bei der man eine beliebige DNA-Sequenz, z. B. ein Gen, in einen Vektor z. B. ein Plasmid integriert. Eine Wirtszelle wird anschließend mit dem Konstrukt aus dem Vektor und der integrierten, zu untersuchenden DNA transformiert (Transformation (Genetik), Gentransfer) und kann dann untersucht werden. Der typische Wirt ist ein Stamm des Bakteriums Escherichia coli.

Ziel einer Klonierung ist, ein kloniertes DNA-Fragment z.B. für In situ-Hybridisierungen zu vermehren oder ein kodiertes Protein rekombinant herzustellen. Solche Proteine spielen eine Rolle

für therapeutische Zwecke (z. B. Insulin etc.)
in der Lebensmitteltechnologie (Lab-Ferment etc.)

Inhaltsverzeichnis

1 Techniken
- 1.1 In vitro-Techniken
  - 1.1.1 Verwendung von Plasmiden
2 Siehe auch

Techniken

Beim Klonieren werden immer sogenannte Vektoren verwendet. Diese dienen als Transportvehikel zur Übertragung eines bestimmten DNA-Strangs in die DNA einer Empfängerzelle. Klonierungstechniken können unterschieden werden in solche, die in vivo (d. h. in einem Lebewesen oder einer lebendigen Zelle) stattfinden, und solche die in vitro (d. h. im Reagenzglas) stattfinden.

In vitro-Techniken

Verwendung von Plasmiden

Beim Klonieren mit Hilfe von Plasmiden werden aus Bakterien Plasmide gewonnen und mit Hilfe spezieller Restriktionsenzyme geschnitten. Die Ziel-DNA, die z. B. in einer PCR-Reaktion aus chromosomaler DNA hergestellt wurde und nun als Insert in den Vektor integriert werden soll, wird mit den gleichen Enzymen geschnitten, so dass komplementäre Enden an Vektor- und Ziel-DNA entstehen (überstehende Einzelstränge, klebrige Enden, "sticky ends"). So ist es nun möglich, den Vektor und das Ziel-DNA-Stück miteinander zu verbinden. Dieser Vorgang, die Ligation, wird durch die T4-DNA-Ligase katalysiert.

Das Vektor-Insert-Konstrukt wird z. B. in spezielle E. coli-Stämme eingeführt, die chemisch- oder elektro-kompetent sind und damit zur Aufnahme der DNA in die Zelle optimiert sind. Hat ein Bakterium das Plasmid ins Zellinnere aufgenommen, so kann es mit Hilfe eines auf dem Plasmid vorhandenen Antibiotikum-Resistenzgens auf einer Agarplatte wachsen, die das Antibiotikum enthält. So werden nur diejenigen Bakterien selektiert, die das Plasmid auch wirklich enthalten. Durch Vermehrung des Bakteriums entstehen Bakterienkolonien (siehe Abbildung, oben). Alle Bakterienzellen, die keinen Vektor tragen, gehen zugrunde (siehe Abbildung, unten). Impft man mit einer solchen Kolonie ein Flüssigmedium an, so vermehren sich die Bakterien. Aus einem solchen Ansatz kann eine große Menge Plasmid-DNA gewonnen werden. Die DNA wird dann für weitere Klonierungen oder zur Proteinüberexpression eingesetzt.