Nährmedium
Ein Nährmedium, auch als Substrat bezeichnet, dient zur Kultur von Mikroorganismen, Zellen und Geweben. Man unterscheidet zwischen flüssigen (zum Beispiel Bouillon, Nährbouillon) und gelierten („festen“) Nährmedien (Nährboden).
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Anwendung
Flüssige Nährmedien werden eingesetzt
- für biotechnologische Produktionsverfahren (siehe Bioreaktor)
- zur Kultivierung von Zellen und Mikroorganismen zu Forschungszwecken
- zur Kultur von lebenden Geweben für den medizinischen Einsatz (z.B. Hauttransplantationen)
- für den Nachweis oder zur Voranreicherung von Mikroorganismen
- zur Prüfung auf bestimmte Stoffwechselleistungen von Mikroorganismen zu deren Identifizierung
- zur Quantifizierung von Mikroorganismen nach der Methode der „Wahrscheinlichsten Anzahl“ („Most Probable Number“ MPN)
Feste Nährmedien werden vor allem zu Analysezwecken verwendet, denn sie ermöglichen auch eine Quantifizierung von Mikroorganismen: Da sich die sich vermehrenden Mikroorganismen nicht frei im Medium verteilen können, bildet sich um jeden auf oder im Nährmedium befindlichen Mikroorganismus eine sichtbare Kolonie.
Die Anzahl dieser Kolonien entspräche also im Idealfall der ursprünglichen Anzahl von Mikroorganismen. Da jedoch eine Kolonie auch von mehreren dicht beeinander liegenden Individuen gebildet werden kann, ergibt die Anzahl der Kolonien tatsächlich nicht der Anzahl der Mikroorganismen, sondern nur der Anzahl der Einzelindividuen und der in Gruppen im oder auf dem Nährboden verteilten Mikroorganismen. Diese Einzelindividuen und Individuengruppen bezeichnet man als KbE (Koloniebildende Einheit, auch cfu - colony forming units).
Weiterhin werden feste Nährmedien verwendet, wenn die sich auf der Oberfläche des Nährmediumgels bildenden Kolonien mit charakteristischem Aussehen zur Charakterisierung und Identifizierung der Mikroorganismen herangezogen werden sollen.
Die Grundzusammensetzung eines Nährmediums besteht meist aus einem Hauptanteil Wasser, sowie einer für den jeweiligen Organismus verwertbaren Energiequelle (organische Stoffe, Schwefel, organische oder anorganische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen) sowie anderen essentiellen Nährstoffen.
Historisch bedingt spricht man bei dem mit Wasser versetztem Substrat von Bouillon, da die ersten Nährmedien noch durch Suppenrezepte hergestellt wurden. Dieser Bouillon wird gegf. ein Geliermittel wie Gelatine oder Agar zugesetzt wenn man einen festen Nährboden benötigt. Heute werden die Nährstoffe samt Geliermittel künstlich zusammengestellt um eine einheitliche, definierte Zusammensetzung zu erreichen. Diese müssen dann nur noch in erhitztem Wasser gelöst und sterilisiert werden.
Die Nährstoffe werden auch Substrate genannt und sind in den meisten Fällen Zucker, Proteine und Fettsäuren. Zusätzlich liefern Nährsalze dem Organismus lebenswichtige Ionen und Moleküle, wie z.B. Ammonium, Kalium, Natrium, Phosphat, Sulfat sowie Spurenelemente.
Daneben können noch enthalten sein:
- Puffersubstanzen um den pH-Wert zu stabilisieren
- Indikatoren um Änderungen anzuzeigen, wie z.B. beim pH-Wert. Aber auch um gewisse Stoffwechselprodukte oder Stoffwechselaktivitäten zu detektieren.
- Farbstoffe bzw. deren Vorstufen (Mikroskopiefarbstoffe, chromogene Substrate)
- Hemmstoffe (zum Beispiel Antibiotika) und selektive Agentien, um das Wachstum unerwünschter Mikroorganismen zu verhindern (z.B. Chloramphenicol für Hefen/Schimmel-Nährböden)
- Wachstumshilfsstoffe (Hormone, Vitamine und dergleichen)
- Gelierungsmittel, wie Agar-Agar oder (seltener) Gelatine
Zur Herstellung eines Nährmediums werden die Nähr- und Zusatzstoffe gemäß einer Rezeptur zusammengemischt und in destilliertem oder demineralisiertem Wasser (erforderlichenfalls unter Erhitzen mit heißem, strömendem Wasserdampf) gelöst. Anschließend erfolgt die Sterilisierung (meist durch Erhitzen im Autoklav). Zusatzsstoffe, die durch die Sterilisierung zerstört würden, werden anschließend nach ihrer Sterilisation auf kaltem Weg (meistens durch Filtration durch einen Sterilfilter) zugegeben.
Arten
Es gibt Festmedien und Flüssigmedien. Beide zielen auf unterschiedliche Anwendungsgebiete ab, bei Festmedien steht die Analyse der jeweiligen Mikroorganismen im Vordergrund, bei Flüssigmedien die Kultivierung von größeren Mengen, die auch zur Keimzahlbestimmung verwendet werden kann. Hierbei wird die Probe in potentiert verdünnte Proben aufgeteilt. Aufgrund dessen, in welcher Verdünnung noch Keime vorzufinden sind, kann man auf die Keimzahl schließen.
Die Zusammensetzungen des Nährmediums, sowie die Kulturbedingungen richten sich jeweils nach dem zu kultivierenden Mikroorganismenstamm. Grundsätzlich gibt es zwei verschiedene Arten von Kulturmedien:
- definierte Medien
- Sie beinhalten eine genau bestimmte Anzahl und Menge an Inhaltsstoffen, die chemisch gereingt werden, um Spuren von anderen Stoffen auszuschließen. Sie dienen häufig zur Selektion des Wachstums bestimmter Mikroorganismen.
- komplexe Medien
- Sie bestehen aus Nährstoffen deren Inhalte nicht chemisch bestimmt sind, wie zum Beispiel Rindfleisch-Extrakt, Caseinhydrolysat, Hefeextrakt. Sie werden am häufigsten verwendet und erlauben das Wachstum fast aller heterotropher Mikroorganismen.
- Minimalmedien
- Sie sind eine Sonderform der definierten Medien und beinhalten nur die minimal nötigen Stoffe für das Wachstum der zu kultivierenden Mikroorganismen; sie können auch als Selektivmedium dienen.
Man verwendet Medien auch, um anhand bestimmter Eigenschaften von Bakterien diese zu selektieren. Dafür gibt es zwei Ansätze:
- Selektivmedium
- Erlaubt nur das Wachstum von bestimmten Mikroorganismen, die besondere Eigenschaften aufweisen, um sich im Medium zu vermehren. Ein Beispiel sind Medien, die mit Antibiotika angereichert sind. In ihnen können nur solche Mikroorganismen wachsen, die gegen das verwendete Antibiotikum resistent sind.
- Differentialmedium
- Erlaubt das Wachstum von mehreren eingesetzten Mikroorganismen. Sie sind jedoch so zusammengesetzt, daß sich Kolonien bilden, die durch Besitz bestimmter Eigenschaften sich von anderen unterscheiden. So können mit Blutagar Stämme identifiziert werden, die zur Hämolyse fähig sind.
Ein bekanntes Medium, das beide dieser Prinzipien vereint, ist der MacConkey-Agar. Er enthält Gallensalze und Kristallviolett und verhindert somit das Wachstum von Gram-positiven Bakterien und wirkt so als Selektivmedium. Für seine Wirkung als Differentialmedium ist Laktose und Neutralrot enthalten, sodass Laktose fermentierende Bakterien anhand eines Farbumschlages des Neutralrotes als pH-Indikator identifiziert werden können .
Fraktionierter Verdünnungsaufstrich
Der Fraktionierte Verdünnungsaufstrich ist eine spezielle Technik, mikrobielle Proben auf den gelierten Nährboden aufzutragen. Hierbei wird slalomartig mit der infizierten Impföse über den Nährboden gefahren, und jeweils zweimal unterbrochen um die Impföse zu sterilisieren und eine neue Fraktion zu beginnen. Mit der Impföse wird jeweils einmal die vorangegangene Fraktion gekreuzt und weiter slalomartig eine neue Fraktion gebildet.
In der Abbildung kann man sowohl die Spur der Impföse noch erkennen, als auch den Effekt des Verdünnungsaufstrichs: in der ersten Fraktion unten links ist noch alles von einer großen Kolonie überwuchert; dies ist allein für eine Bestimmung der meisten Keime ungeeignet. In der zweiten Fraktion oben links sind bereits Einzelkolonien zu sehen, in der letzten Fraktion auf der rechten Seite sind es nur noch Einzelkolonien. Einzelkolonien entstehen aus einer einzigen Zelle, die sich dort von der Impföse gelöst hat. Man kann so auch grob abschätzen wie hoch die Keimkonzentration der Probe ist, selbst für eine grobe Keimzahlbestimmung ist das Verfahren aber ungeeignet.
Einzelkolonien können aufgrund allein von Form und Farbe eine Keimbestimmung ermöglichen. Escherichia Coli erkennt man z.B. an kugelrunden Einzelkolonien, die dunkelviolett sind und metallisch glänzen. Eine ganz genaue Keimbestimmung ist allerdings nur über die besonders teure und zeitaufwändige DNS-Analyse möglich. Standardverfahren zur Keimbestimmung ist nach wie vor die sehr schnelle Gram-Färbung.
Durch Entnehmen einer Probe von einer Einzelkolonie kann man außerdem eine garantiert reine Probe eines Mikroorganismusses gewinnen und diesen frei von Verunreinigungen weiter vermehren.
Liste von Nährmedien
Die Zusammensetzungen der Medien wird nach Anwendungsgebiet und dem zu kultivierenden Mikroorganismen ausgewählt. Hier sind einige der bekanntesten, in der medizinischen Bakteriologie und Zellbiologie verwendeten aufgeführt.
- Önöz-Agar:Der entscheidende Vorteil des Nährbodens liegt in der schnelleren bakteriologischen Diagnose, da nach ÖNÖZ die Kolonien von Salmonella und Shigella deutlich und sicher von anderen Enterobacteriaceae unterscheidbar sind. Im Vergleich zum Leifson-Agar und zum SS-Agar ist die Ausbeute an Salmonella aus Stuhlproben höher.
- Wilson-Blair-Agar (Bismut-Sulfit-Agar)
- Leifson-Agar (Desoxycholat-Citrat-Agar)
- ENDO-Agar (Fuchsin-Sulfit-Lactose-Agar)
- LB-Medium
- SOB-Medium
- MacConkey-Agar
- Minimalmedium 9
- Blutagar
- Brilliantgrün-Galle-Laktose-Bouillon
- Fleischwasser
- Kochblutagar
- Nähragar
- YPD-Medium
- TY-Medium
- DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)
- E-MEM (Eagle's minimal essential medium)
- RPMI: vorwiegend Leukozyten
- Kligler-Schrägagar
- Malzextrakt-Agar (MEA)
- Dichloran-Glyzerin-Agar (DG18)
- Wilson-Blair-Agar (Wismutsulfit Agar)
- Galle-Äsculin-Agar
- VRB-Agar (Kristallviolett-Galle-Lactose-Agar)Dient der Differenzierung gramnegativer Bakterien
- Kimmig-Agar (Pilzanzucht in der medizinischen Mikrobiologie)
- Sabouraud-Dextrose-Agar
- Columbia-Blut-Agar
- Casein-Soja-Pepton-Agar auch Casein-Soja-Pepton-Bouillon (CASO)
Weblinks
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